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过氧化氢酶的测定方法,过氧化氢酶活性测定,土壤过氧化氢酶的测定,过氧化氢酶测定

发布时间:2013-02-09 来源: 过氧化氢酶活性

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酵母过氧化氢酶(CAT)的测定方法 一、CAT提取 1.准备材料、仪器及试剂 材料:酵母:5g 仪器:天平、电子天平 研钵(1个),石英砂,玻璃匀浆器 冰箱(1台) 玻璃棒(1个) 高速离心机 离心管 容量瓶(1000ml、100ml) 量筒 SephadexG-75柱 试剂:Na2HPO4、 NaH2PO4 (0.1M磷酸缓冲溶液 (PBS) :

PH=7.0 , 20ml)、 (NH4)2SO4 1.1 0.1M PBS配制 母液的配制 配制时,常先配制0.2mol/L的 NaH2PO4和0.2mol/L的Na2HPO4,两者按一定比例 混合即成0.2mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS),根据需要可配制不同浓度PBS。

0.2M Na2HPO4:称取 71.6g Na2HPO4-12H2O,溶于 1000ml 水 ; 0.2M NaH2PO4:称取 31.2g NaH2PO4-2H2O,溶于1000ml 水 (3)0.2mol/L pH5.7~8.0的PBS的配制如下:取n ml 0.2mol/L的 NaH2PO4和m ml 0.2mol/L的 Na2HPO4·12H2O,充分混合即为0.2mol/L的PBS. 若pH偏高或偏低,可通过改变二者的比例来加以调整,室温保存即可。

pH 0.2M NaH2PO4(ml)(n) 0.2M Na2HPO4(ml)(m) 5.7 93.5 6.5 5.8 92 8 5.9 90 10 6.0 87.7 12.3 6.1 85 15 6.2 81.5 18.5 6.3 77.5 22.5 6.4 73.5 26.5 6.5 68.5 31.5 6.6 62.5 37.5 6.7 56.5 43.5 6.8 51 49 6.9 45 55 7.0 38 62 7.1 33 67 7.2 28 72 7.3 23 77 7.4 7.5 7.6 7.7 7.8 7.9 8.0 19 16 13 10.5 8.5 7 5.3 81 84 87 89.5 91.5 93 94.7 0.1MPBS配制 0.1M PBS (PH=7.0) :

取 500ml 0.2M PBS{38ml 0.2M NaH2PO4 (ml) +62 ml 0.2M Na2HPO4 (ml)},加水稀释至 1000ml 即可。

2.CAT提取 称取干酵母5g→研磨→加20 mL 0.1 mol/L (pH7.0 )磷酸盐缓冲液(PBS)→4℃下 放置30 min→玻璃匀浆器研磨20 min(使酵母细胞充分破壁,释放出酶) →10000 r/min(4℃)离心15 min→取上清液作为粗酶液(用于测定CAT活性,并用于进一步纯 化) 3.CAT的提纯 以上的粗酶上清液中加人固体(NH4)2SO4,使其饱和度达到70%→4℃静置15 min→4℃用14 000 r/min离心15 min→取上清液→测定CAT活性→上清液中加人固体 (NH4)2SO4,使其饱和度达到80% → 4℃静置15 min →14 000 r/min离心15 min→ 取沉淀→沉淀用1 mL 0.1 mol/L的PBS(pH7.0)溶解→测定CAT活性。

将此液上SephadexG-75柱→于4℃下层析→用0.1 mol/L的PBS( pH7.0)洗脱→ 用自动部分收集器收集洗脱液,速度控制在每管3.5 mL/5 min→测定每管的CAT活力 及蛋白含量。一直收集到没有酶活性为止。 4.酶活力及蛋白浓度测定 CAT活力测定用紫外分光光度法进行。在30℃下,取2.9 mL含0.1%H202的PBS(0.1 mol/L pH7.0)放人752型分光光度计,加人稀释酶液0.1 mL,立即在240 nm,波 长处测定该混合体系在3 min内光吸收值的变化。底物浓度控制在A240nm=0.5左 右(参考文献:林少琴,兰瑞芳,余萍 贻贝过氧化氢酶的纯化及部分性质[期刊 论文-食品科学2000 (11))。蛋白质浓度参照Brad-ford(参考文献:

Bradford MM A rapid and sensitive method for the quantitafion of microgram quantities of protein utilizing the principle of proteindye binding[外 文期刊]1976 (1-2))的方法测定,以牛血清白蛋白作标准。每分钟每毫克蛋白 质在240 nm波长下使光密度值下降0.001定义为一个酶活力单位(Umg-1 protein min-1)。各测定均重复5次。 5.CAT 光谱的测定 将 CAT 在 H66025 超声发生器上用一定参数的超声波处理后, 立即用 960 MC 荧光光度计测 定其荧光发射光谱。

并用原纯酶作对照。

用 UV-2401 PC 型光谱仪分别测定 CAT 纯酶和经超 声波处理过的 CAT 纯酶的紫外吸收光谱。并在 UV-2401 PC 光谱仪测定用超声处理后 CAT 的紫外差示光谱。 6.CAT 的催化动力学分析 以不同浓度的底物测定经超声处理过的 CAT 和未经超声处理过的 CAT 的反应速度,用 Lineweaverburk 作图法作出双倒数曲线图,求出米氏常数(Km)和最大反应速度(Vmax) 。

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